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Metodi d´analisi

Il monitoraggio delle acque di balneazione si esegue stagionalmente attraverso il prelievo di campioni il cui numero (non inferiore a 5) è stabilito annualmente dalla Regione Emilia-Romagna. Il primo è considerato aggiuntivo e va prelevato poco prima dell´inizio della stagione balneare. Le indagini analitiche si effettuano su due parametri microbiologici (Escherichia coli ed Enterococchi intestinali) che determinano l´idoneità dell’acqua alla balneazione. Il superamento dei limiti anche di uno solo dei due parametri determina il divieto temporaneo dell´intera acqua di balneazione. La revoca del divieto si realizza in seguito al prelievo di un campione conforme ai limiti di legge.

 

MODALITA´ DI CAMPIONAMENTO

Le modalità di campionamento sono definite nell´Allegato D del D.M. 30/03/2010. I prelievi devono essere effettuati nella fascia di mare normalmente utilizzata dai bagnanti ad una profondità di circa 30 cm sotto il pelo dell´acqua e ad una distanza dalla battigia tale per cui il fondale sia compreso tra gli 80 e i 120 centimetri ad eccezione delle aree in cui sono presenti scogliere a picco o fondali rapidamente degradanti per le quali i prelievi vanno realizzati nei pressi della scogliera o della battigia stessa. Nel litorale emiliano romagnolo le profondità previste si trovano a poche decine di metri dalla battigia, con variabilità legata ai livelli di marea. I campionamenti si eseguono, come indicato dalla normativa, tra le ore 9 e le 16 e sono registrati su appositi verbali. Al momento del prelievo dell´aliquota d´acqua necessaria per la determinazione dei parametri microbiologici vengono rilevati e riportati a verbale anche i seguenti parametri meteomarini:

  • Temperatura dell´aria (° C);
  • Temperatura dell´acqua (° C);
  • Vento:direzione ed intensità;
  • Stato del mare, direzione di provenienza delle onde, stima visuale dell´altezza d´onda;
  • corrente superficiale: intensità e direzione;
  • condizioni meteorologiche: presenza di pioggia, copertura nuvolosa.

L´aliquota deve essere prelevata con contenitore sterile trasparente della capacità di almeno 500 ml e conservata ad una temperatura di circa 4°C fino all´arrivo in laboratorio dove verrà sottoposta ad analisi quanto prima, possibilmente in giornata e comunque entro le 24 ore.

 

MODALITA´ ANALITICHE

Le determinazioni microbiologiche sono effettuate dal Laboratorio della Struttura Oceanografica "Daphne" di Arpae a Cesenatico.

Sono adottati i metodi di prova previsti dalla normativa vigente:

- Escherichia coli (Colilert-18®/Quanti-Tray®);

- Enterococchi intestinali (Enterolert®-E/Quanti-Tray®).

 

ESCHERICHIA COLI - Il metodo Colilert-18®/Quanti-Tray® è basato sulla tecnologia Defined Substrate Technology (DST) a multipozzetto. Prevede un’incubazione del campione, opportunamente diluito, a 44± 0,5°C per 44±4 h, ma la maggior parte dei batteri Escherichia coli produce un risultato positivo in 24 ore. I substrati nutritivi utilizzati, distribuiti in serie di pozzetti (Quanti-Tray®) in cui è inoculato il campione da saggiare, sono addizionati di composti cromofori e fluorigeni che, idrolizzati dagli specifici enzimi (la β-D-galattosidasi e la β-D-glucuronidasi) prodotti dai microrgamismi ricercati, rendono possibile l’evidenziazione della loro crescita tramite la colorazione gialla dei pozzetti e conferma della comparsa di fluorescenza blu sotto luce ultravioletta 365 nm (Figure 1 e 2).

 

Figura 1: Colilert dopo incubazione: 
pozzetti gialli, 
presuntivamente positivi

Figura 2:Colilert dopo incubazione esposto a luce ultravioletta per conferma:pozzetti fluorescenti per la presenza di Escherichia coli.

 

ENTEROCOCCHI INTESTINALI - Il metodo impiegato per il rilevamento di Enterococchi intestinali in acque marine è Enterolert®-E/Quanti-Tray® a tecnologia definita (Defined Substrate Technology DST) e a multipozzetto. Il campione, opportunamente diluito, viene incubato a 41± 0,5°C per 24 h. Quando gli Enterococchi sono presenti utilizzano il loro enzima β-glucosidasi per metabolizzare il nutriente-indicatore di Enterolert® , il 4-metil-umbelliferil β-D glucoside, rilasciando il composto 4-metilumbelliferone che osservato sotto una luce ultravioletta a 365 nm emette un segnale fluorescente blu (Figura 3).

 

Enterolert-E

Figura 3: Enterolert dopo incubazione esposto a luce ultravioletta.

 

Entrambi i metodi richiedono, quando sono usati con acque marine, una diluizione di 1:10 in acqua sterile. Il conteggio delle concentrazioni per entrambi i microrganismi ricercati viene ottenuto con il metodo Quanti-Tray® o Quanti-Tray®/2000 (vassoi monouso da 51 o 97 pozzetti) che permette la quantificazione semiautomatizzata basata sul modello dei Metodi Standard del numero più probabile (Most Probable number MPN). Il laboratorio della Struttura Oceanografica Daphne utilizza il metodo di enumerazione Quanti-Tray®/2000 a 97 pozzetti che rende possibile per le acque marine quantificare entrambi i microrganismi ricercati nell’intervallo tra <10 e 24190 MNP per 100 ml.

 

Nella tabella sottostante sono descritti sinteticamente i metodi impiegati.

Tabella metodi analitici