Metodiche analitiche dei campioni di acque di balneazione

Ai fini della classificazione della qualità delle acque di balneazione, la Direttiva individua due indicatori di contaminazione fecale di provata rilevanza sanitaria, Escherichia coli ed Enterococchi intestinali. Gli standard di qualità microbiologica delle acque stabiliscono per questi batteri, a tutela della salute umana, i limiti di concentrazione che non devono essere superati. Questi organismi in genere non causano direttamente disturbi, ma sono buoni indicatori della presenza di patogeni (virus, protozoi, batteri) nelle acque. La scelta di ricercare batteri indicatori anziché i singoli agenti patogeni potenzialmente presenti nell´ambiente è dovuta al fatto che il rilevante numero di quest´ultimi, la loro diversa natura e metodi di ricerca più impegnativi renderebbero molto più lunga e laboriosa la diagnosi di laboratorio. L´Agenzia di Protezione Ambientale statunitense (US-EPA,1986) ha dimostrato che l´Escherichia coli e gli Enterococchi intestinali sono i migliori organismi indicatori della presenza di patogeni che causano disturbi gastro-intestinali.

Escherichia coli,  appartenente al gruppo dei coliformi, è una specie tassonomicamente definita della famiglia Enterobacteriaceae, microrganismo a forma di bastoncello, anaerobico facoltativo, Gram-negativo, asporigeno. Questa specie vive nell´intestino dell´uomo e degli animali a sangue caldo ed è sensibile a molti disinfettanti chimici e fisici.

Gli Enterococchi intestinali, che costituiscono un sottogruppo degli streptococchi, sono così indicati con un termine funzionale usato per indicare gli streptococchi normalmente presenti nel tratto intestinale degli uomini e degli animali e comprendono varie specie. Sono in grado di sopravvivere e moltiplicarsi in un´ampia gamma di condizioni ambientali, capacità che spiega la loro distribuzione pressoché ubiquitaria e la loro permanenza in ambiente acquatico, in seguito a episodi di inquinamento, più lunga rispetto a quella di Escherichia coli.

Le determinazioni microbiologiche per le acque di balneazione sono effettuate dal laboratorio della Struttura Oceanografica "Daphne" di Arpae a Cesenatico. Sono adottati i metodi di prova previsti dalla normativa vigente:

  • Escherichia coli (metodo UNI EN ISO 9308-2:2014)
    Metodo basato sulla crescita degli organismi bersaglio in un mezzo liquido e sul calcolo del "più probabile numero" (MPN, Most Probable Number), sfruttando la tecnologia Defined Substrate Technology (DST) a multipozzetto. Prevede un’incubazione del campione, opportunamente diluito, a 36± 2°C per 18-22 h. I substrati nutritivi utilizzati, distribuiti in serie di pozzetti (Quanti-Tray®) in cui è inoculato il campione da saggiare, sono addizionati di composti cromofori e fluorigeni che, idrolizzati dagli specifici enzimi (la β-D-galattosidasi e la β-D-glucuronidasi) prodotti dai microrgamismi ricercati, rendono possibile l’evidenziazione della loro crescita tramite la colorazione gialla dei pozzetti e conferma della comparsa di fluorescenza blu sotto luce ultravioletta 365 nm (Figure 1 e 2).
  • Enterococchi intestinali (Enterolert®-E/Quanti-Tray®).
    Il metodo impiegato per il rilevamento di Enterococchi intestinali in acque marine è Enterolert®-E/Quanti-Tray®, metodo basato sulla crescita degli organismi bersaglio in un mezzo liquido e sul calcolo del "più probabile numero" (MPN, Most Probable Number), sfruttando la a tecnologia definita (Defined Substrate Technology DST) e a multipozzetto. Il campione, opportunamente diluito, viene incubato a 41± 0,5°C per 24 h. Quando gli Enterococchi sono presenti utilizzano il loro enzima β-glucosidasi per metabolizzare il nutriente-indicatore di Enterolert® , il 4-metil-umbelliferil β-D glucoside, rilasciando il composto 4-metilumbelliferone che osservato sotto una luce ultravioletta a 365 nm emette un segnale fluorescente blu (Figura 3).
Fig. 1 Colilert dopo incubazione:  pozzetti gialli, presuntivamente positivi Fig. 2 Colilert dopo incubazione esposto a luce ultravioletta per conferma:pozzetti fluorescenti per la presenza di Escherichia coli Fig. 3 Enterolert dopo incubazione esposto a luce ultravioletta
Figura 1 Figura 2 Figura 3

Entrambi i metodi richiedono, quando sono usati con acque marine, una diluizione di 1:10 in acqua sterile. Il conteggio delle concentrazioni per entrambi i microrganismi ricercati viene ottenuto con il metodo Quanti-Tray® o Quanti-Tray®/2000 (vassoi monouso da 51 o 97 pozzetti) che permette la quantificazione semiautomatizzata basata sul modello dei Metodi Standard del numero più probabile (Most Probable Number MPN). Il laboratorio della Struttura Oceanografica Daphne utilizza il metodo di enumerazione Quanti-Tray®/2000 a 97 pozzetti che rende possibile per le acque marine quantificare entrambi i microrganismi ricercati nell’intervallo tra <10 e 24190 MPN per 100 ml.


Nella tabella sottostante sono descritti sinteticamente i metodi impiegati.

Metodiche analitiche